細胞介紹

使用甲氨蝶呤將HT29細胞分化成成熟的杯狀細胞。從該細胞克隆中分離出分泌粘液的HT29-MTX亞克隆，并對緊密連接的形成、融合單層的發(fā)育和粘液層的產(chǎn)生進行表征。HT29-MTX-E12提供了一個模型系統(tǒng)來研究粘液層對納米粒子擴散的影響。

一、細胞特性

1） 來源：HT29細胞分化  人 結腸腺癌

2） 形態(tài)：上皮樣細胞  貼壁生長

3） 含量：>1x10^6  細胞數(shù)

4） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5)  用途：僅供科研使用。

6) 培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

A. 準備DMEM培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%； L-谷氨酰胺（2mM）1%；NEAA  1% ，雙抗 1% 。                      

血清推薦WinSera   FBS500-WP-002

B.培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

C.凍存液：90%胎牛血清，10%DMSO 現(xiàn)用現(xiàn)配。

凍存液推薦WinSera  WS-1026-50ml/100ml

  儲存：液氮儲存

二、運輸和保存

干冰運輸及復蘇好存活細胞

1.復蘇發(fā)貨  a.T25瓶活細胞發(fā)貨或 b.血清重懸發(fā)貨
2. 凍存管發(fā)貨(干冰發(fā)貨)  

A.1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉入液氮或直接復蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。

B.T25瓶復蘇的存活細胞常溫發(fā)貨，收到后按照細胞接收后的處理方法操作。

三、 細胞處理：

1） 凍存細胞的復蘇：

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁細胞傳代可以參考以下方法

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細胞可以適當延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。

3. 輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進行。

3）細胞凍存: 收到細胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細胞種子以備后續(xù)實驗使用。

下面T25瓶為例；

1. 細胞凍存時按照細胞傳代的過程收集消化好的細胞到離心管中，可使用血球計數(shù)板計數(shù)，來決定細胞的凍存密度。一般細胞的推薦凍存密度為1×10^6~1×107個活細胞/ml.

2. 1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細胞凍存液重懸細胞 ，按每1ml凍存液含1×10^6~1×107個活細胞/ml分配到一個凍存管中將細胞分配到凍存管中，標注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

3. 將要凍存的細胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。

備注：

1. 運輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細胞，請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞。  收到細胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代 。

2.培養(yǎng)條件一般不是一成不變，以實驗室發(fā)貨備注培養(yǎng)條件為準。